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色谱分离技术

2014-11-06

色谱分离技术

色谱分析是20世纪初在研究植物色素分离时发现的一种物理的分离分析方法，借以分离及鉴定结构和物理化学性质相近的一些有机物质。色谱分析具有高效、灵敏、准确等特点。

色谱分析是基于分析样品各组分在不相混溶并作相对运动的两相(流动相和固定相)中的溶解度的不同，或在固定相上的物理吸附程度的不同等而使各组分分离。

分析样品可以是液体、固体(溶于合适的溶剂中)或气体。流动相可以是有机溶剂、惰性载气等。固定相则可以是固体吸附剂、水或涂渍在担体表面的低挥发性有机化合物的液膜，即固定液。

常用的色谱分析法有：(1)薄层色谱法，(2)柱色谱法，(3)纸色谱法，(4)气相色谱法，(5)高效液相色谱法。

2.6.1薄层色谱（TLC）

薄层色谱属于固—液吸附色谱。样品在涂在玻璃板上的吸附剂(固定相)和溶剂(移动相，又称展开剂)之间进行分离。由于各种化合物的吸附能力各不相同，在展开剂上移时，它们进行不同程度的解吸，从而达到分离的目的。

薄层色谱展开时间短(几十分钟就能达到分离目的)，分离效率高(可达到300～4000块理论塔板数)，需要样品少(数微克)。可用于：①证实两个化合物是否相同；②测定混合物中组分的数目；③监控一个有机合成反应的进程；④决定适用于柱层析分离用的溶剂；⑤检查或监控通过柱层析、重结晶或萃取所达到的分离的效果等。

1. 薄层板的制备

⑴吸附剂

常用的吸附剂是硅胶和氧化铝，常用的粘合剂是煅石膏、羧甲基纤维素钠和聚乙烯醇等，硅胶中参入13％的煅石膏后成为硅胶G，没有掺煅石膏的叫硅胶H，有的含有荧火物质，如硅胶HF254。

氧化铝的极性比硅胶大，比较适应于分离极性较小的化合物，因为极性化合物被氧化铝强烈吸附，分离较差。

硅胶使用于分离极性较大的化合物，因非极性化合物在硅胶板上吸附较弱，分离较差。

⑵制板方法

取5g硅胶G与13ml 0.5~1%羧甲基纤维素钠的水溶液在研钵中调匀，铺平在清洁、干燥的玻璃片上，可手动振平，也可用涂布器刮平（图2.6-1），大约可铺10′4cm玻璃片8~10块，薄层的厚度约0.25mm。室温晾干后，在110℃烘箱内活化半小时，关闭烘箱电源，在烘箱中放至室温后即可使用。

图2.6-1 薄层色谱板的制备

2. 展开溶剂

选择合适的展开溶剂是至关重要的，所选的展开溶剂必须使待分离的化合物在薄层板上能够获得最大的展开距离。一般来说，极性化合物选择极性展开溶剂；非极性化合物选择非极性展开溶剂。当一种展开溶剂不能达到分离时，还可选用混合展开溶剂。薄层色谱常用的展开溶剂有：戊烷、四氯化碳、苯、氯仿、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇和甲醇等。实际常用的是极性介于两种展开溶剂之间的混合展开溶剂。

3. 操作方法

⑴点样

将样品用低沸点溶剂配成1~5%的溶液，用内径小于1mm的毛细管点样。点样前先用铅笔在薄层板上距一端1cm处轻划一横线作为起始线，然后用毛细管吸取样品，在起始线上小心点样，斑点直径不超过2mm，如需重复点样，须待前次点样溶剂挥发后，方可重点，以防样点过大，影响分离效果。若同一板上要点两个或两个以上样点，样点间距在1~1.5cm为宜。样点干燥后，方可进行展开（图2.6-2）。

⑵展开

薄层色谱的展开需要在密闭的容器中进行（图2.6-2）。将选择好的展开溶剂倒入展开器中，展开溶剂的高度为0.5cm，先加盖使展开器内气体饱和几分钟，将点样的薄层板样点一端向下斜放入展开器内，样点不能浸入展开溶剂内，加盖展开。当展开溶剂上升到离薄层板的顶部约1cm处时取出薄层板，立即标出前沿位置。

图2.6-2 薄层色谱板的点样、展开及展开示意图

⑶显色

待展开剂挥发后，观察斑点位置，若化合物有色则可直接观察到各斑点的位置。若样品无色，则需在紫外灯下观察或用碘熏显色法，也可用喷显色剂的方法进行显色。

显色

碘熏显色法：将薄层板放入装有少量碘的密闭容器中，许多有机化合物都能和碘形成棕色斑点。但当薄层板取出之后，在空气中碘逐渐挥发，谱图上的棕色斑点就消失了。所以显色之后，要立即用铅笔将斑点位置画出。

喷显色剂显色法：将显色剂或其溶液装入小型喷雾瓶中，对薄层板用嘴吹气进行喷雾，然后晾干或用电吹风吹干，即可显示出斑点。常用的显色剂有碘、浓硫酸、三氯化铁溶液等。如芳族伯胺可与二甲氨基苯甲醛生成黄—红色的希夫(Schiff)碱，羧酸可用酸碱指示剂显色等。

⑷Rf值（比移值）的计算

比移值Rf是表示色谱图上斑点位置的一个数值。每个有机化合物在相同的实验条件下，其Rf值是确定的。因此，可利用和标准样品的Rf值进行比较来鉴定有机化合物。良好的分离，Rf值应在0.15~0.75之间，否则应该调换展开剂重新展开。一般来说，吸附剂是强极性的，而展开剂的极性相对较小的，故在展开的薄层板的上端是极性小的化合物。